質粒小科普

質粒(Plasmid)是廣泛存在于生物界中的環狀雙鏈DNA分子。目前在細菌、放線菌、真菌和不少動植物細胞中均發現有質粒的存在，其中細菌質粒是研究最深入、應用較廣泛的^[1]。因為質粒分子本身具有復制功能的遺傳結構，可攜帶一些遺傳信息，并且其自我復制能力和攜帶遺傳信息能力非常強大，經過基因表達后可使其宿主細胞表現相應的性狀，所以質粒常被用作基因載體，在分子生物學、生物化學與細胞生物學等學科中得到廣泛的應用^[2]。

圖1 大腸桿菌質粒分子結構示意圖

質粒提取方法及原理

質粒的提取是分子克隆中常用的一種技術，即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒的過程。質粒的質量直接影響到基因操作的后續步驟，如轉化、酶切和序列分析等，因此獲得足夠量的質粒是質粒應用的重要一步。生物學實驗中質粒的獲取方式主要是通過在大腸桿菌中擴增，從而獲取大量的含有目的基因的載體質粒。其主要過程是對感受態細菌進行轉化，挑取克隆菌落，在LB培養基中搖菌進行擴增和質粒抽提^[3]。科研工作者已經開發出很多質粒抽提的方法，目前普遍采用的質粒提取方法主要有堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有機溶劑法等。堿裂解法提取質粒具有得率高，適用面廣、快速、純度高等特點，因此堿裂解法目前被廣泛采用。下面著重介紹堿裂解法提取質粒的原理。

圖2 質粒提取過程

堿裂解法提取質粒主要原理是利用共價閉合環狀質粒和線性染色質在拓撲學上的差異。利用NaOH和SDS溶液使細胞裂解，在堿性溶液中，線性的大分子量細菌染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構遭破壞而發生變性，但由于質粒DNA分子量相對較小，且呈環狀超螺旋結構，即使在高堿性pH條件下，兩條互補鏈也不會充分分離。當加入中性緩沖液調和時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，而染色體DNA不能復性，它們之間交聯形成不溶性網狀結構，并與細胞碎片、蛋白質、SDS等結合沉淀下來。通過離心沉淀，細胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質等可被除去，而質粒DNA小分子量的RNA留在上清液中，混雜的RNA用RNaseA除去。一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質粒DNA。由于堿裂解法的眾多優勢，市面上大多數的質粒抽提試劑盒基本采用的方法是堿裂解法。

質粒提取分類

大多數實驗室都會選擇基于堿裂解法的質粒提取試劑盒來提取質粒，根據不同的樣本量及獲取目標質粒的產量分為質粒小提、質粒中提、質粒大提。

1、質粒小提

質粒小提主要是對于1-5mL的菌液中質粒DNA進行小量提取，獲得的質粒用來進行常規的載體構建實驗。

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1、采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，粗提物通過過濾柱除去內毒素； 
2、離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。
3、特殊的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除。有效防止了質粒被核酸酶降解。
4、特別內毒素清除方法，清除內毒素效果一般小于<0.1EU/μg。

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2、質粒中提

質粒中提是在質粒小提的基礎上進一步去除菌液中的內毒素，獲得的質?？梢杂糜诩毎D染，常規需要菌液量為10-15mL。

3、質粒大提

質粒大提與中提方法相同，一次可對100-200mL菌液進行抽提，從而獲得大量質粒。

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1、高效提取中大量菌液質粒DNA，提取菌液量：5mL、10mL、20mL、50mL、100mL或以上；
2、提取質粒DNA純度高，可高效去除質粒中污染的內毒素，內毒素去除率可高達90%以上，有效提升質粒轉染實驗的成功率；
3、真空濃縮，大幅提升洗脫液中質粒DNA濃度，DNA濃度可達2ug/uL以上；
4、用于培養菌液樣本中質粒DNA的提取，提取后的質粒DNA可用于細胞轉染、酶切、PCR、測序、體外轉錄與翻譯、構建文庫等多種分子生物學實驗。

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質粒提取其實并不難，但是選擇符合我們實驗的質粒提取方法和試劑盒非常重要，因為又快又好地提取出符合下游實驗要求的質粒，無疑會對我們的實驗起到錦上添花的作用。

本期的分子小課堂就到這里啦，祝大家實驗順利，我們下期再見啦！

[1] Lars M?lbak, Tett A, Ussery D W, et al. The plasmid genome database.[J]. Microbiology, 2003, 149(Pt 11):3043-5. DOI:10.1099/mic.0.C0123-0.

[2] Diaz Ricci J C ,Hernández ME. Plasmid Effects on Escherichia coli Metabolism[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2000, 20(2):79-108. DOI:10.1080/07388550008984167.

[3] Li G , Liu J , Chen N, et al. A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth[J].Bioengineered, 2020, 11(1):1080-1083.DOI:10.1080/21655979.2020.1827893.

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