腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環境中一種可塑性異質細胞群體，占某些實體腫瘤的50%，TAMs通常表現出免疫抑制M2表型，導致預后不良。TAMs通過刺激血管生成，增加腫瘤細胞的遷移和侵襲，抑制抗腫瘤免疫引起惡性發展。由于TAMs的高度可塑性，將抗炎巨噬細胞極化為促炎巨噬細胞是一種很有前途的抗腫瘤方法。目前常用的策略是通過局部或全身給藥來輸送外源性物質，如免疫因子、單抗和免疫激動劑。然而，在不影響正常凝血的情況下，精確誘導腫瘤出血的新材料仍面臨挑戰。

近日，南京大學吳錦慧教授團隊在 ADVANCED MATERIALS（IF=29.4）上發表了題為“Flagella of Tumor-targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy"的研究論文。他們通過基因工程技術構建了一種腫瘤靶向多鞭毛細菌(flhDC VNP)，從而實現了精確的腫瘤出血。flhDC VNP在腫瘤中定植，并在增殖過程中過度表達鞭毛。鞭毛促進腫瘤壞死因子TNFα 的表達，從而導致局部腫瘤出血。出血時滲入的紅細胞使巨噬細胞暫時極化為M1亞型。在青蒿琥酯(artesunate，Arts)存在下，其與血紅素(heme)形成一種絡合物，不斷產生活性氧(ROS)使暫時的極化轉變為持續的極化。因此，腫瘤靶向細菌鞭毛可能為重新編程TAMs和改進抗腫瘤治療開辟新的策略。

圖1  觸發局部出血和TAM重新編程的腫瘤靶向細菌的鞭毛示意圖

FlhDC VNP和?flhD VNP的構建及鑒定

研究團隊首先在減毒沙門氏菌VNP20009(Vnp)中引入高表達flhDC質粒，構建flhDC VNP細菌。通過阿拉伯糖(abs816776)的誘導，flhDC VNP成功表達由超表達質粒編碼的熒光蛋白tdTOMATO、鞭毛和flhDC蛋白。為了研究鞭毛是否可以穩定過表達，他們連續傳代了持續表達flhDC蛋白的flhDC VNP，表明flhDC VNP的鞭毛過表達相對穩定。掃描電子顯微鏡觀察，表明 flhDC VNP鞭毛的數量遠遠高于未經編輯的VNP。通過敲除細菌基因組中的flhD基因構建鞭毛缺陷沙門氏菌ΔflhD VNP，掃描電子顯微鏡觀察表明ΔflhD VNP表面無鞭毛。為了研究鞭毛的數量對細菌的運動是否是必要的，研究者進行了瓊脂封閉式Transwell試驗。flhDC VNP能在2 h內迅速穿透瓊脂，而VNP和ΔflhD VNP幾乎不能穿透瓊脂。在3D細胞組織中的進一步實驗表明，flhDC VNP穿透更深。因此，這些結果表明，他們成功構建了穩定表達的flhDC VNP和ΔflhD VNP，且細菌的運動能力隨著鞭毛數量的增加而增強。

圖2  多鞭毛細菌的構建與表征

FlhDC VNP誘導腫瘤出血

為了研究鞭毛數量的增加是否會增加細菌在腫瘤中的積累，研究人員將等量的VNP，flhDC VNP和ΔflhD VNP靜脈注入荷瘤小鼠體內，在不同時間取小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）進行細菌計數，結果所有細菌在腫瘤中的積聚隨著時間的推移而增加。此外，在注射細菌72小時后，flhDC VNP在腫瘤中的積聚量是VNP和ΔflhD VNP的10倍。這些數據表明，鞭毛數量的增加有利于腫瘤內細菌的增殖。在其他器官中，由于免疫細胞的清除作用，細菌的分布呈現緩慢下降的趨勢。

為了探究鞭毛數量的增加是否可以增加血液中炎性細胞因子的分泌，他們比較了靜脈注射flhDC VNP、ΔflhD VNP和VNP后腫瘤壞死因子TNFα 的濃度隨時間的變化。結果表明，注射后1h血液中TNFα 濃度最高，并且flhDC VNP刺激TNFα 分泌的作用明顯高于ΔflhD VNP和VNP。由于腫瘤血管的低流速和高通透性，過量的炎癥因子可能會破壞腫瘤血管。隨著時間的推移，腫瘤出血加重，在注射細菌12h時，腫瘤內的紅細胞浸潤量達到最大。注射細菌后12h取材，蘇木精伊紅(H&E)染色。注射flhDC VNP的腫瘤含有最多的浸潤性紅細胞。這些數據表明，flhDC VNP在腫瘤內積聚，通過增加炎性細胞因子水平而導致腫瘤出血。

圖3  細菌誘導TNFα 分泌增加并且誘導腫瘤出血

Heme與Arts反應形成能極化巨噬細胞的復合體

正常情況下，滲透的紅細胞被巨噬細胞吞噬。在巨噬細胞內，紅細胞分解為血紅蛋白，血紅蛋白被消化為血紅素。然后，血紅素通過HRG1從內體運輸到巨噬細胞胞漿。血紅素能與含有過氧化鍵的抗瘧疾藥物發生特異性反應，如Arts。當Arts被低價過渡金屬絡合物（血紅素）激活時，弱過氧化鍵發生均質斷裂產生ROS。研究人員發現，血紅素和Arts結合產生了一種具有過氧化物酶活性的復合物。過氧化物酶可以催化過氧化氫產生羥基自由基，同樣也可以增加細胞內ROS的產生。

ROS水平升高會影響巨噬細胞的表型。ROS通過MAPK信號通路、NF-kB信號通路、NOD樣受體和改變線粒體膜電位促進促炎巨噬細胞極化。研究結果表明，Arts-血紅素復合體顯著增加巨噬細胞的促炎表型。促炎調節是通過改變線粒體膜電位來調節的。因此，紅細胞與Arts形成復合體，通過改變線粒體膜電位和激活NLRP3炎性小體，增加巨噬細胞內ROS水平，極化TAMs。

圖4  血紅素heme與青蒿琥酯Arts反應產生ROS持續極化巨噬細胞

FlhDC VNP與Arts聯合應用極化巨噬細胞并促進腫瘤炎癥微環境

由于巨噬細胞在腫瘤中的占比高達50%，并且具有高度可塑性，因此研究團隊進一步研究flhDC VNP和Arts聯合給藥后TAMs的表型變化。結果顯示，flhDC VNP聯合Arts顯著增加了促炎TAMs的比例，降低抗炎TAMs的比例。巨噬細胞的促炎極化可能改變腫瘤的免疫微環境。對腫瘤的轉錄組分析顯示，flhDC VNP和Arts可以上調多個炎癥相關基因以及多種炎癥信號通路、細胞趨化因子通路和免疫系統過程通路，如TNF信號通路、NF-κB信號通路和趨化因子信號通路。因此，flhDC VNP和Arts聯合應用可使TAMs極化為促炎表型，增加腫瘤免疫細胞的浸潤，從而使腫瘤免疫微環境從“冷瘤"轉變為“熱瘤"。

圖5  FlhDC VNP與Arts聯合給藥腫瘤免疫微環境表征

FlhDC VNP聯合Arts對不同腫瘤模型的抗腫瘤作用

最后，研究團隊通過靜脈注射細菌結合腹膜內注射Arts來評估flhDC VNP在CT26異種移植瘤模型中的抗腫瘤作用。結果表明，當flhDC VNP與Arts聯合作用時，Arts的抗腫瘤作用增強。此外，為了更好的模擬腫瘤生長環境，研究人員用原位結腸腫瘤模型來評估其抗腫瘤作用。結果同樣證實flhDC VNP增強了Arts的抗腫瘤作用。進一步的研究表明，flhDC VNP聯合Arts對CT26移植瘤、原位CT26結腸癌和化療耐藥黑色素瘤均有一定的抗腫瘤作用，并能增強TCR-T細胞治療的抗腫瘤作用。

圖6   FlhDC VNP聯合Arts的抗腫瘤效果

綜上所述，腫瘤靶向細菌鞭毛可能為重新編程TAMs和重塑腫瘤免疫微環境以改進抗腫瘤治療開辟新的策略。此研究具有廣闊的應用前景，并獲得國家重點研發計劃、國家自然科學基金的大力資助。

小愛科普：腫瘤，始終是科研熱榜的“Top 1"， 腫瘤除了有“良惡"之別，還有“冷熱"之分。根據腫瘤微環境中免疫細胞的空間分布情況，將腫瘤分為三種基本的免疫表型：免疫炎癥型、免疫排斥型和免疫沙漠型。其中免疫炎性腫瘤即為“熱腫瘤",免疫排斥瘤和免疫沙漠瘤皆可稱為“冷腫瘤"。上述研究由愛必信（上海）生物科技有限公司提供阿拉伯糖(abs816776)促進減毒沙門氏菌表達外源基因，除此之外愛必信還為廣大科研學者提供多種高品質腫瘤研究相關小分子激動劑/抑制劑和生化試劑，助您科研探索之路不斷創新和突破！

[1] XuHH, Xiong SQ,Chen YY, et al. Flagella of Tumor-Targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-Associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy[J]. Mater. 2023, 2303357.

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