我們做實驗的時候，會發現做免疫組化整張片子染的臟臟的一片紅的情況，而這其中有很多原因。以下是對免疫組化一片紅的總結：

1. 抗體用了多抗?

一抗用多抗很容易出現非特異性染色，建議用高純度的針對更具特異性抗原決定簇的單抗來解決。單抗很貴，不過效果很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成悲劇，所以要注意抗體的有效期。

2. 抗體濃度過高/孵育時間過長

一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體前應該多做預實驗，摸索出理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調好定時器，提醒自己及時終止反應，就會避免這個問題。

3. DAB染色時間太長/變質

DAB的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現用現配，臨用前才加入H2O2。

4. 內源性酶和生物素

內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；對于內源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。

5. 組織變干

一下子染太多片子的時候，容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣3-4 mm。

6. 浸泡時間過長

切片在緩沖液或修復液里面浸泡過一夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。獨門秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，過一夜*沒有問題。

7. 清洗不充分

清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。

8. 封閉血清問題

是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。在這再貢獻一個獨門絕招，直接用奶粉也可以。用5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎么樣？簡單吧。

免疫組化是個苦活臟活。步驟多，時間長，還要接觸有毒有害的物質。要是好好的一張片子染出來都是全國江山一片紅就得不償失了。

以上呢就是我們今天想給大家分享的內容，那這么多的注意事項，對于新手來說，有沒有更為簡便的方案呢

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