在當今生物醫學研究領域，多重熒光免疫組化(mIHC)技術正變得越來越重要。這項技術能夠在單一組織切片上同時檢測多種蛋白質，為我們提供了一個強大的工具，以揭示細胞和組織內部復雜的生物學信息。隨著多重熒光免疫組化技術的不斷發展，越來越多老師希望在自己的片子上看到更豐富的靶標信息，意味著我們需要用到更多種熒光染料去完成染色，但由于熒光染料產生的信號不是單純的線性，而是呈現山峰狀的分布，在最高點信號固然最好，但在最高點左右的一段范圍內都能夠捕獲到它的信號，那么相鄰的染料之間，難免會有信號的重疊，導致最后的結果無法被準確判讀。那么如何來解決這個問題呢？

首先，我們需要選擇合適的染料，明辨激發光和發射光，且不會導致熒光背景增強，選擇相距波長較遠的熒光染料是避免信號重疊的關鍵。例如，Absin提供的多色試劑盒中，四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI）的染料組合，這些染料之間幾乎不會有串擾的情況。

其次，染色順序的優化至關重要。我們建議從zui低豐度靶點（搭配亮度zui強的熒光染料）開始順序染色，以最高豐度靶點（搭配亮度弱的染料）結束。此外，通過增加一抗濃度、降低熒光濃度或改變抗體的染色順序，都可平衡各靶點染料的搭配。

染料搭配一般遵循“寡靶配強光，眾靶配弱光"的原則，意思是表達比較弱的指標搭配熒光信號比較強的染料，表達相對強的指 標搭配信號比較弱的染料，Absin的TSA染料波長越短熒光強度越強，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發現樣本中PD-1的信號很少，CD3信號非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1， TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。

接下來就是怎么安排染色先后順序：

1）劃分細胞定位，先外后內：確定每個指標的細胞定位，膜表達先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標比較多的情況下，胞內指標排在比較后面，經過前期多輪洗脫，可以不做細胞通透；如果指標很少，染胞內指標之前還是需要打孔，多個胞內指標也只需要打一次孔）；

2）確定抗原修復方式，先酸后堿：堿修復比酸修復的力度會更強，個別抗體在用堿修復以后會染出來很多非特異性，所以如果是相同的細胞定位，就先染酸修復，再染堿修復的抗體；

3）根據IHC結果判別，先弱后強：組化結果顯示指標比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標效果會越接近單標染色；

4) 根據抗原指標的類型判斷：一抗種類（洗脫難度：結構性膜蛋白和細胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）；除非有些抗體如E-cadherin（鈣粘附蛋白E）、EpCAM（上皮細胞粘附分子）、Tuj1（β-III微管蛋白）與抗原結合十分牢固或者洗脫有問題，可降低一抗濃度， 增加洗脫時間或將這些抗體放到TSA標記的最后一輪做在實驗設計中，我們還需要考慮抗體的特異性和交叉反應性。使用經過高度驗證的抗體，確保得到可靠的結果。通常而言，經過IHC-P驗證的抗體，同樣也能在mIHC中使用，但需要再進行實驗步驟優化。

此外，我們愛必信的多色技術采用了酪胺信號放大(TSA)技術，這允許我們在一張組織切片上實現多個靶標蛋白的共染色，最多可同時標記數十種蛋白。TSA技術的一個關鍵優勢在于可以使用同一物種的多種一抗，而無需擔心會發生交互作用，這大大簡化了多重檢測設計過程。

染色順利做完后怎么能少的了分析呢？目前市面上數據分析軟件還是比較多的，像免費的您可以下載imageJ、Qupath，缺點就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件。從功能、分析的精準度和可操作性來說，肯定是大大優于開源軟件的，且有軟件專業的技術支持團隊能夠答疑解惑。您可以根據您的實際情況選擇合適的分析軟件，如果您實在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數據分析的服務~

HALO分析（可以做單細胞層面和空間分析）；單細胞水平分析包括：單細胞總細胞計數（染核）；單（多）陽性細胞計數、百分比、平均強度；空間水平分析包括：計算任意兩個細胞之間的平均距離、最近的細胞的鄰近度或滲透分析，數據分析結果以EXCEL形式/直方圖交付。

StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺自帶的（基本所有的病理領域的分析需求都能滿足，可以出組織流式散點圖，直方圖），如下是StrataQuest分析軟件直出的散點圖和直方圖。

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