在之前的文章中，小愛為大家介紹了IHC的原理以及樣本處理的實驗要點：答應我，看完再做IHC（上）今天我們繼續看看接下來的實驗流程及操作要點。首先還是先來回顧一下IHC的整體流程：

前期樣品處理的過程包括載玻片的制備，脫蠟/復水，抗原修復（上期內容），然后我們需要做樣品的封閉，孵育一抗和二抗，以及底物檢測，最后的處理步驟包括脫水，封片和觀察。PART1我們介紹了樣品制備環節，今天我們繼續看下PART2抗體孵育及檢測。

PART2 抗體孵育及檢測

（1）淬滅：如果使用基于酶或者生物素的檢測系統，樣本中內源性酶的活性（過氧化物酶/堿性磷酸酶）或者內源性生物素會對檢測產生非特異性干擾，因此在血清封閉之前需要先對樣品進行淬滅。根據使用的二抗偶聯標記不同，使用對應的內源性封閉液進行淬滅。

小技巧：使用免疫組化筆在樣本周圍畫圈建立疏水隔離區，可以避免樣品間的交叉染色和節約血清和抗體的用量。
 

操作步驟：將組織切片畫上阻水圈，每切片加100μL（用量以浸沒樣本區域為準，可靈活調節） 3% H2O2，室溫下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。

（2）封閉：使用血清對樣品中非特異性結合位點進行封閉。一般建議在TBST/PBST中加入5%的山羊血清作為封閉液。

需要注意如果使用酪蛋白封閉液（例如牛奶），可能會影響磷酸化抗體的識別。

操作步驟：每張切片加100μL（用量以浸沒樣本區域為準，可靈活調節）5%山羊血清封閉液，室溫孵育30min。

（3）孵育一抗：抗體孵育可以選擇直標一抗的方式或者無標記的一抗再偶聯HRP標記的二抗。間接檢測的方式可以進行信號放大，靈敏度更高，是更為常規的檢測方式。一抗用于與樣品中的靶標抗原進行特異性結合。

在選擇IHC一抗的時候應注意以下幾點：

1、一抗的反應種屬：一抗的反應種屬應與樣品的種屬一致，并且一抗的宿主來源不同于樣品種屬。例如：如果樣品是小鼠的腫瘤，應選擇針對于小鼠的抗體；

2、一抗的特異性：抗體的特異性不好，容易引起非特異性染色，單克隆抗體的特異性優于多克隆抗體。標記mAb的一般是指單克隆抗體；

3、查看抗體說明：查看抗體說明書上面的應用，注意有些抗體僅適用于IHC-P而不適用于IHC-F，根據樣本類型進行選擇；例如下面這個抗體可以適用于IHC-P。

操作步驟：在樣品處加入稀釋后的目的蛋白抗體，置入4℃冰箱內過夜，PBST浸洗3min×3次。

（4）孵育二抗：二抗與一抗結合，并帶有偶聯標記。

在選擇IHC二抗的時候應注意以下幾點：

a. 二抗的反應種屬應與一抗的宿主來源相同；

b. 多標IHC/IF實驗中，建議優先選擇經過預吸附處理的二抗，可以避免不同物種間抗體的交叉反應；

c. 某些細胞和組織（巨噬細胞、B細胞、自然殺傷細胞，淋巴結組織，脾臟組織等）表面內源性的Fc端受體過多，建議使用F(ab')?形式的二抗以避免其與樣品Fc受體非特異性結合。

操作步驟：在樣品上添加對應的二抗，室溫孵育1h，PBST浸洗3min×3次。

（5）底物檢測：IHC通過酶和底物反應在抗體結合處顯色以檢測抗原表達。顯色檢測中需要根據抗體上的偶聯標記來選擇對應的底物，常見的偶聯標記有HRP和AP。二抗上帶有HRP標記時，一般選擇DAB作為底物進行檢測。

操作步驟：配制即用型DAB工作液，滴加新鮮配制的DAB工作液到切片上，wan全覆蓋標本。通常顯色1-10min，DAB顯色時間需要鏡下控制，選擇最佳顯色時間，做好防護。自來水沖洗終止DAB顯色反應。

（6）蘇木素復染：蘇木素經氧化后生成蘇木精，是一種堿性染料，組織學中用于細胞核的染色，染色后的細胞核呈鮮明的藍色或藍紫色，可以更方便的查看細胞形態。

操作步驟：滴加適量蘇木素以覆蓋整個組織，復染 30sec~3min。用自來水wan全沖洗掉復染液。酸酒精（在100ml 70%乙醇中加入1ml鹽酸）分化3-5sec后水洗30sec，終止反應。去離子水沖洗切片 3~5min，使胞核返藍。

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二抗檢測試劑盒用于IHC實驗，包含經過條件摸索和實驗驗證的最佳搭配試劑和實驗方案，試劑盒中包含淬滅劑，封閉液，一抗放大劑，酶標二抗聚合物和顯色底物。由于IHC實驗一般信號較弱，需要信號放大，建議使用二抗檢測試劑盒。

1、減少一抗用量，一抗可再稀釋2-4倍；

2、Polymer酶標二抗檢測系統，更低背景；

3、快速便捷，更短孵育時間，鼠兔通用；

4、單品文獻100+，認可度高。

PART 3 封片和觀察

（1）脫水：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、重復兩次。

（2）中性樹脂封片：在玻片上滴加一滴中性樹脂，從側邊緩緩蓋上蓋玻片，動作應盡量緩慢，以防止產生氣泡。

IHC常見問題

【高背景】

1、封閉問題

封閉不好是最常見的導致高背景的原因，切記要注意以下幾個方面：首先封閉液的濃度我們可以適當增加，并延長封閉時間，來達到更好的封閉效果；其次容易忽略的是我們通常采用稀釋的動物血清作為封閉液，這時就要注意血清的種屬，最好使用與二抗同種屬來源，切記不可使用與一抗同種屬來源。

2、抗體濃度

有時一抗的濃度太高會導致較高的背景，因此我們可以在原有一抗濃度的基礎上提高稀釋度，并減少抗體孵育的時間，來達到降低背景的目的。當然這也和抗體的效價有關，記得認真查看抗體廠家的建議稀釋比。

3、內源性物質影響

常見的為內源過氧化物酶和內源生物素，記得要使用H2O2和Avidin來進行封閉處理（abs9333和abs9335）。

【信號弱】

1、抗體影響

廠家在生產抗體的時候會做抗體應用檢測，記得查看自己的抗體是否能運用于IHC；其次，抗體的效價較弱，這是我們可以通過提高抗體濃度來增強結果的信號；最后，大家切記在保存熒光二抗的時候要避光。

2、樣本保存

應選擇新鮮組織進行實驗，樣品取出后應盡快放入固定液中。固定液現用現配。

3、樣本個體差異
從Uniprot或者Atlas網站上查看蛋白的定位，修飾等信息，并查詢蛋白在不同種屬和組織間的表達情況。或者可以先使用其他方法（如WB，Flow等）對樣品先進行篩選或設立陽性對照。

【樣本形態不好】

1、掉片問題

如果出現樣本切片掉片問題，記得使用多聚賴氨酸（abs9170）處理過的玻片，可以有效防脫。另外石蠟切片要注意烤片的溫度和時間，以60℃，2-4個小時為最佳。

2、固定問題

固定時一定要保證固定的時間和固定液（abs9179）的體積，固定時間至少在8小時以上，同時固定液的體積至少要是組織塊的20倍左右。

3、抗原修復問題

抗原修復不要使用太過劇烈的條件，尤其是對于一些硬質組織樣本，本身比較容易脫片。可以適當摸索下修復時間。

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