概述

腫瘤微環境(tumor microenvironment, tme)是由腫瘤相關基質細胞、免疫細胞，以及相應細胞的分泌產物（如細胞因子和趨化因子）和細胞外基質(ecm)中的非細胞成分組成的。腫瘤微環境為腫瘤提供了良好的生長環境和營養物質，促進腫瘤的進展和轉移，這也是臨床中導致許多個體患者常規治療失敗的原因。腫瘤類器官相對于pdx動物模型，體外培養環境相對單純，而缺乏腫瘤微環境的類器官模型，又很難wan全模擬腫瘤對于藥物的反應性，特別是免疫細胞隨著腫瘤類器官的培養，會逐漸功能下降、數量減少，甚至于逐漸消失。

目前類器官的培養方法是機械破碎法，使用彈力剪將腫瘤組織剪成1mm³的碎片，加入培養液，在水平搖床上震蕩培養。研究結果證明，隨著類器官的培養腫瘤免疫細胞會大量的損失，腫瘤免疫微環境受到了很大的破壞。有文獻報道采用氣液交互法(air-liquid interface, ali)培養組織來源的類器官，可以在一定程度上保留組織原位的免疫微環境。今天，給大家介紹采用ALI方法培養類器官的方法。

培養方法

原代

一、準備工作

1、儀器設備

CO₂培養箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床，醫用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。

2、試劑耗材（以肺癌為例）

人肺癌類器官培養試劑盒(abs9443)、基質膠（低因子、無酚紅）(abs9495)、60mm細胞培養皿(abs7005)、100μm濾篩(abs7009)、15mL離心管（尖底，無菌無酶）(abs7120)、1.5mL EP管若干(abs7119)、細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)、金屬冰盒(abs7289)、眼科剪刀、眼科鑷。

人肺癌類器官培養試劑盒(abs9443)

基質膠（低因子，無酚紅）(abs9495)

二、操作步驟

 1、細胞小室底層凝膠基質的制備

（1）基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

（3）融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

低溫金屬冰盒(abs7289)

（4）在細胞培養超級凈臺中，用100uL槍頭吸取50uL基質膠加入細胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養箱，靜置40-60min直到基質膠凝固為止。

2、樣本準備

（1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫院/實驗室取回；

（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。

3、清洗-剪碎

在60mm細胞培養皿(abs7005)里用2-3mL原代培養緩沖液B浸泡。用原代培養緩沖液B清洗三次（每次更換培養皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉移至15mL離心管。

4、消化-過濾

（1）向15mL離心管中加入5倍原代組織消化液C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難，使用5mL消化液通常足夠）在4℃進行消化15-30min（消化過程中隨時觀察消化情況）。

（2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細胞團（5-50個細胞抱團）后， 加入3倍體積原代培養緩沖液B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。

（3）使用100μm濾篩(abs7009)進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察。將濾液收集到15mL離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清。

5、加膠-點板-加液（這里是整個原代操作的點睛之筆）

（1）準備工作

a. 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c. 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個細胞小室孔加入50uL基質膠細胞團混合物。

（3）接種密度

密度建議1：基質膠體積：細胞團沉淀體積=25:1（如果估摸細胞團沉淀體積困難，通常加300uL基質膠足夠）

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），向每個鋪了基質凝膠的小室內加入50uL細胞團基質膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性）。將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺，向下培養孔加入適量類器官培養基，培養基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層（如下圖），這樣就可以形成ALI微環境。

（6）將培養板放于培養箱，每2天換一次液，大概10-14天，多數類器官直徑在100um以上，可進行傳代操作。

傳代（消化分兩種情況）

一、細胞小室底層凝膠基質的制備

1、基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

2、槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

3、融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完；

4、在細胞培養超級凈臺中，用100uL槍頭吸取50uL基質膠加入細胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養箱，靜置40-60min直到基質膠凝固為止。

二、類器官數量較多或體積較大傳代步驟

1、類器官收集及洗滌

（1）收集：用移液器吸去外培養孔的培養基，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠和類器官，收集在15mL離心管中（24孔板，每5個細胞小室孔為一組）。

（2）洗滌：加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

（3）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、類器官消化

（1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺內消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細胞團為主，千萬不要消化成單細胞，單細胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數微升鏡下觀察，如果有較多細胞團可停止消化。

（2）添加5倍類器官傳代培養緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a. 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c. 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個細胞小室孔加入50uL基質膠細胞團混合物。

（3）接種密度

密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，細胞小室收集5孔，傳代10孔，需要的基質膠量50*10=500uL；

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）；

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍。

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），向每個鋪了基質凝膠的小室內加入50uL細胞團基質膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性）。將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺，向下培養孔加入適量類器官培養基，培養基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環境。

（6）將培養板放于培養箱，每2天換一次液，大概7-10天，多數類器官直徑在100um以上，可進行傳代操作。

三、類器官數量不足或體積較小時：

1、類器官收集、吹打、洗滌

（1）收集：用移液器吸去下培養孔的培養基，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠和類器官，轉移到下培養孔。

（2）進行吹打，將類器官吹成細胞團（可取樣鏡下觀察有較多細胞團時可停止吹打）；

（3）洗滌：24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

（4）接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留細胞團沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠細胞團混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠細胞團混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

2、加膠-點板-加液

（1）準備工作

a. 基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

b. 槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

c. 融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

（2）接種要求

細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個細胞小室孔加入50uL基質膠細胞團混合物。

（3）接種密度

密度建議1： 對于類器官數量較少的情況，為了維持生長所需的旁分泌信號，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質膠量50*3=150uL。

密度建議2：1000個細胞團/50uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），向每個鋪了基質凝膠的小室內加入50uL細胞團基質膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性）。將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠。

（5）加液

含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺，向下培養孔加入適量類器官培養基，培養基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環境。

（6）將培養板放于培養箱，每2天換一次液，大概7-10天，多數類器官直徑在100um以上，可進行傳代操作。

凍存

凍存要領：

類器官不需要消化（消化后的類器官復蘇活率低）；

在類器官指數增長期凍存（等到該傳代的時候類器官活性比指數期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數類器官直徑在100um-200um，這個時機選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌

1、收集：用移液器吸去下培養孔的培養基，向每個細胞小室添加1mL左右4℃類器官傳代培養緩沖液G，輕柔吹散基質膠和類器官，收集在15mL離心管中（24孔板，每5個細胞小室孔為一組）。

2、洗滌：加類器官傳代培養緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質膠軟化，如果冰箱保溫效果強，縮短冷凍時間，摸索合適的冷凍時間時，可取出離心管搖晃看不到基質膠說明冷化好了）。

3、接下來將離心管進行300g，4℃，離心5min，離心完通常會有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關。此時棄掉緩沖液，留下基質膠類器官混懸液，重復上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現清晰分層（緩沖液層、基質膠層、類器官沉淀層），此時棄掉上清和基質膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質膠類器官混懸液層），此時棄掉緩沖液和上1/3的基質膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進基質膠和類器官有效分離條件：

a. 離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離；

b. 離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

二、類器官凍存

1、凍存密度，以細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)為例

密度建議1：2個細胞小室孔/mL凍存液

密度建議2：500個類器官/mL凍存液（如果想計數凍存，可以參照此密度建議）

2、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，建議立即進行凍存。（放置太久，DMSO對類器官有損傷）

3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

     手動凍存：4℃冰箱放置30min，轉移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。

復蘇

一、實驗前準備

1、將水浴鍋預熱至37℃；

2、細胞實驗室進行常規消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；

3、在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養板等。

二、細胞小室底層凝膠基質的制備

1、基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

2、槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

3、融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完；

4、在細胞培養超級凈臺中，用100uL槍頭吸取50uL基質膠加入細胞小室（注意鋪展均勻），將小室放入24孔板，將孔板放入培養箱，靜置40-60min直到基質膠凝固為止。

三、取出凍存管

1、根據類器官凍存記錄按標簽找到所需類器官的編號；

2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。

四、迅速解凍

1、迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中地液體迅速融化；

2、約1-2min后凍存管內液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內。

五、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。

六、加膠-點板-加液

1、準備工作

（1）基質膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過夜融化；

（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預冷至少半小時；

（3）融化后的基質膠可一直放4℃儲存，建議2周內用完。

2、復蘇要求

細胞小室（PET膜，6.5mm，孔徑0.4um，含24孔板）(abs7280)，每個細胞小室孔加入50uL基質膠細胞團混合物。

3、復蘇密度

復蘇密度建議1：1:1接種（原來凍了幾個細胞小室孔就復蘇幾個細胞小室孔）；

復蘇密度建議2：500個類器官/50uL基質膠（如果想計數接種，可以參照此密度建議）

4、加膠-點板

向細胞團沉淀加入基質膠(abs9495)，進行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產生氣泡），向每個鋪了基質凝膠的小室內加入50uL細胞團基質膠混懸物，（整個操作在金屬冰盒或冰上進行，操作熟練以后，加膠，混勻，點板控制在半分鐘內，有利于保持基質膠良好的流暢性）。將鋪好的培養板放入37℃培養箱中40-60min成膠。

5、加液

含組織的上層凝膠凝固以后，將24孔板放入超凈臺，向下培養孔加入適量類器官培養基，培養基的水平面不得超過上面的細胞凝膠層，這樣就可以形成ALI微環境。

6、培養

將培養板放于培養箱，每2天換一次液，大概10-14天，多數類器官直徑在100um以上，可進行傳代操作。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺交流哦！

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