概述：

生命誕生于3D環境，所以傳統的2D細胞培養方法，雖然可以保證細胞的生長和對外界刺激產生生理反應，但是和實際生活環境的巨大差異會導致大部分生理功能受限。比如，2D培養環境下的細胞間的相互作用是XY軸的，只是細胞層之間的作用，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養環境下細胞可以變成細胞球，從而可以體現出Z軸細胞之間的力作用和各種物質的滲透梯度，和體內的差異相較2D細胞層會大大縮小，從而提高體外細胞實驗的準確性。利用體外培養的腫瘤細胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要。

本期小愛帶大家學習腫瘤球培養過程，介紹3種培養攻略：3D腫瘤球瓊脂糖-基質膠培養攻略、3D腫瘤球基質膠培養攻略、3D腫瘤球超低吸附培養攻略。

一、3D腫瘤球瓊脂糖-基質膠培養攻略

以乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環境掃描電鏡對其進行詳細表征。

實驗步驟：

1、實驗前準備工作

1）提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養基（含10%FBS(abs972)，下同）于50mL離心管內，置于4℃冰箱中預冷；
2）將分裝好的Matrigel基質膠(abs9490)提前24h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態；
3）將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內，置-20℃冰箱預冷。

2、瓊脂糖包被96孔板

1）準確量取6mL RPMI 1640培養基（或DMEM培養基）于2個10mL的注射玻璃瓶內，加入90mg瓊脂糖(abs44056213)，蓋塞后放入80℃的水浴鍋內加熱溶解30min；
2）加熱結束后，將注射瓶放入滅菌鍋內，115℃滅菌30min；
3）滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺內。將注射瓶內的瓊脂糖溶液倒入無菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔60μL的量加入96孔板內。

注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固，因此從滅菌鍋內取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉移至超凈臺內并迅速加入至96孔板中。

此外，為保證加樣時瓊脂糖不冷卻，需要同時滅菌加樣槽和100μL的移液器槍頭。

4）加入完成后，96孔板要保持水平約30min使孔內的瓊脂糖凝固。

3、配置含Matrigel基質膠細胞懸液

1）取對數生長期的MDA-MB-231細胞（或MCF-7細胞），胰蛋白酶(abs47014938)消化后進行細胞計數，用RPMI 1640培養基（或DMEM培養基）將細胞懸液濃度調整至2.0×10⁵cells/mL，備用；
2）將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內，將RPMI 1640培養基以及解凍的Matrigel基質膠從冰箱內取出置于冰上；

注意：由于Matrigel基質膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫。

3）將預冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內。根據計算量（2.5%，v/v）用移液器將300μL Matrigel基質膠加入到12mL RPMI 1640培養基內，迅速混勻；

注意：由于Matrigel基質膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要預冷。

4）加入步驟1中的細胞懸液（約600μL），使細胞濃度為10000cells/mL，迅速混勻，備用；

4、將細胞懸液鋪入瓊脂糖包被的96孔板

1）將上述步驟4中配置好的含有Matrigel基質膠的細胞懸液放入加樣槽內，用多通道移液器吸取200μL加入到包被瓊脂糖的96孔板內；
2）采用微孔板離心機(abs72035)進行離心，離心條件為4℃，1000×g，10 min。

注意：離心96孔板時為保持無菌，將96孔板的周圍用封口膜封住。

3）離心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養箱內培養。整個培養流程如圖1所示。

圖1

4）在培養的第3、5和7天，更換孔內的100μL培養基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態。

圖2

5）若要采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗，在培養7天后，用移液器取出孔內的100μL培養基，加入100μL給藥溶液，然后置于培養箱內培養并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況（圖2）。

5、3D多細胞腫瘤球的表征

1）倒置顯微鏡觀察3D多細胞腫瘤球形態：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可。
2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst 33258(abs47047617)對細胞核進行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察（圖3）。

圖3

3）環境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球，用PBS(abs962)清洗3遍后，固定干燥后進行環境掃描電鏡觀察（圖4）。

圖4

常見問題：

在實踐中，我們常常面臨細胞無法成球狀的問題。下面我們探討3D細胞培養中細胞不能成球狀的原因，以及針對這些問題的解決方法。

1、細胞類型和特性：

細胞的類型和特性是影響其在3D環境中形成球狀結構的關鍵因素之一。不同類型的細胞具有不同的自組織和黏附性能，可能更適合形成其他類型的3D結構，如片狀、管狀等。
解決方法：在進行3D培養實驗之前，必須仔細選擇適合自組織的細胞類型。對于不易形成球狀結構的細胞，可以嘗試使用誘導因子或基因調控方法來促進其自組織能力。

2、細胞外基質(ECM)缺乏或不適當：

細胞成球狀通常需要適當的細胞外基質支持。如果培養基中的ECM成分不足或不適當，細胞可能無法形成球狀。
解決方法：合理設計培養基中的ECM成分，確保細胞有足夠的支持來形成球狀結構。此外，可以考慮添加外源性ECM支持物質，如適當的基質蛋白、生物活性的材料等。

3、細胞密度不足：

細胞成球狀可能需要足夠的細胞密度來支持細胞間的相互作用和自組織。如果細胞密度過低，可能會影響球狀結構的形成。
解決方法：優化細胞接種密度，確保足夠的細胞數參與自組織過程。

4、培養條件不適當：

培養條件如培養基成分、溫度、氧氣濃度等可能會影響細胞成球狀的能力。不適當的培養條件可能阻礙了細胞的自組織能力。
解決方法：通過優化培養條件，創造一個更有利于細胞自組織的環境，例如調整培養基成分、溫度和氣體濃度。

二、3D腫瘤球基質膠培養攻略

1、實驗前準備工作

1）準備好細胞培養試劑；

2）將分裝好的Matrigel基質膠(abs9495)提前24h從-20℃放入4℃，使其融化成液體狀態；將無菌的1mL移液器槍頭放入無菌50mL離心管內，置-20℃冰箱預冷。

2、加膠點板

1）取對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化后進行細胞計數（例如24孔板，一孔點25uL基質膠細胞混懸液，細胞數量7000/25uL基質膠），取特定細胞數300g，4℃，離心5min，棄上清，取細胞沉淀備用；
2）解凍的Matrigel基質膠從冰箱內取出置于金屬冰盒上（也可以用盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內）；

注意：由于Matrigel基質膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持低溫，槍頭，EP管，離心管，金屬冰盒要提前-20℃預冷。

3）向細胞沉淀加入基質膠（金屬冰盒或冰上操作），迅速混勻并點板（控制在半分鐘為佳，時間久了基質膠會凝集產生氣泡）。以24孔細胞培養板為例，每孔點膠25uL組織基質膠混合物（呈液滴狀），將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠，添加500-750μL培養基進行培養；
4）在培養的第3，5，7天，給細胞球換液，并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球形態；
5）若采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗，在培養7天后，用移液器取出孔內的100uL培養基，加入100uL給藥溶液，然后至于培養箱內培養并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球生長狀況。

3、3D多細胞腫瘤球表征

1）倒置顯微鏡觀察：直接將96孔板置于顯微鏡下觀察即可；

2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內腫瘤球，用PBS清洗3遍，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst33258(abs811667)，PBS洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察；

3）環境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，固定干燥后進行環境掃描電鏡觀察。

三、3D腫瘤球超低吸附培養攻略

以乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7為例制備3D多細胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環境掃描電鏡對其進行詳細表征。

1、實驗前準備工作

1）提前24h取12mL DMEM(abs9483)和RPMI 1640(abs9484)培養基（含10%FBS(abs972)，下同）于50mL離心管內，置于4℃冰箱中預冷；
2）瓊超低吸附培養板（96孔板，圓底）(abs7060)。

2、配置細胞懸液

取對數生長期的MDA-MB-231細胞（或MCF-7細胞），胰蛋白酶(abs47014938)消化后進行細胞計數，用RPMI 1640培養基（或DMEM培養基）將細胞懸液濃度調整至1.43 x 10⁵cells/mL（即10000細胞/70μL）或其他濃度（即2500細胞/70μL，500細胞/70μL，100細胞/70μL），根據自己的實驗需求選擇其中一個濃度或配置適合自己實驗的濃度。

3、將細胞懸液鋪入超低吸附96孔板

1）將上述步驟2中配置好的細胞懸液放入加樣槽內，使用移液器輕輕吹打細胞懸液以保證濃度均一，用多通道移液器吸取細胞懸液加入到超低吸附96孔板內，每孔70μL。
2）蓋上板蓋，室溫下離心，250 RCF，2min；

注意：離心96孔板時為保持無菌，將96孔板的周圍用封口膜封住。

3）離心完成后，取出96孔板，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養箱內培養，并保持斜立（與水平面夾角30度，如下圖），此過程可以將培養板的一側墊高；

圖5

4）在培養的第3、5和7天，更換孔內的100μL培養基并采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的形態；
5）若要采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗，在培養7天后，用移液器取出孔內的100μL培養基，加入100μL給藥溶液，然后置于培養箱內培養并定期采用倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況。

4、3D多細胞腫瘤球的表征

1）倒置顯微鏡觀察3D多細胞腫瘤球形態：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察即可；
2）激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球，用PBS清洗3遍后，采用4%多聚甲醛(abs9179)固定，并用Hoechst 33258(abs47047617)對細胞核進行染色，PBS清洗3遍后在激光共聚焦顯微鏡下觀察；
3）環境掃描電鏡觀察：用移液器小心取出孔內的腫瘤球，用PBS(abs962)清洗3遍后，固定干燥后進行環境掃描電鏡觀察。

今天講解就到這了，大家如有3D腫瘤球或類器官問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺交流哦！

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