“你好，我的樣本是養的細胞，我還能做多色組化嗎？”

答案是可以！對于多重熒光免疫組化（mIHC）來說，幾乎不挑剔樣本類型，但需要攻克一個難題——多輪洗脫。傳統的組織樣本經過前期處理固定包埋，再加上防脫載玻片的助力，在洗脫過程中，脫片概率相對小，即使有小部分脫落，但影響不至于很大；而細胞樣本，有可能在一張片子上，本身細胞數量就不多，如果還有脫落，可能最后“顆粒無收”。今天Absin分享的是細胞樣本做多色的方法，其中不能缺少的依舊是我們的“老演員”——抗體洗脫液（abs994）。

一、建議操作步驟：

1）樣本準備：制備細胞樣本（細胞爬片、細胞涂片等），建議直接使用腔室載玻片進行細胞培養，方便后續檢測。完成制備后，用PBS簡單漂洗（2×2min）；
2）細胞固定：用4%多聚甲醛常溫固定10-20min，PBS洗滌3×5min；
3）淬滅內源性過氧化物酶：滴加3% H₂O₂，室溫下孵育10-30min，PBS洗滌3×5min；
4）細胞通透（胞膜指標省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液，室溫下處理10min，PBS洗滌3×5min；
5）封閉：滴加封閉液（5%二抗同來源封閉血清或BSA），室溫孵育30min；
6）一抗孵育：棄封閉液，滴加稀釋好的一抗工作液，于避光濕盒內4°C孵育過夜或37℃ 1-2h（濕盒中可加少量水，防止抗體孵育過程干片），PBS漂洗3×5min；
7）二抗孵育：滴加與一抗相應種屬的HRP二抗覆蓋組織，避光室溫孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；
8）染料孵育：滴加現配的1*TSA染料工作液（使用信號放大液按1:100稀釋），反應1-10min，PBS漂洗3×5min；
9）抗體洗脫：抗體洗脫液37℃預熱，甩去PBS后，滴加洗脫液浸潤整個爬片，洗脫時間可控制在15-30min（洗脫難度：結構性膜蛋白和細胞骨架蛋白＞胞漿蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；
10）重復進行步驟[5→9]，直到完成所有指標染色；
11）滴加1*DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區域，室溫孵育10min，PBS漂洗3×5min；
12）滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡；
13）掃描成像，數據分析。

二、注意事項：

1）若某些抗體難以洗脫，建議降低一抗稀釋比例，或將該靶點排到最后一輪進行染色；
2）抗體洗脫液在使用時要根據實際情況調整孵育時間和洗脫溫度，若時間太長有可能損傷抗原靶點以及細胞核形態；
3）若既有膜指標又有胞內指標，可先做膜指標，再做胞內指標，在進行胞內指標染色之前再進行打孔，若一開始就打孔，可能影響胞膜指標的染色；
4）由于細胞樣本可能存在的脫片問題，可在開始多色實驗之前先模擬多次抗體洗脫的過程，多次使用抗體洗脫液洗脫與PBS漂洗，觀察細胞脫落情況，若明場不便觀察，可染一下DAPI再觀察；
5）上述操作步驟并不一定適合所有樣本和抗體，需要根據實際情況調整實驗細節。

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