What is Co-IP?
Co-IP全稱Co-Immunoprecipitation,中文學名免疫共沉淀,是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎,用于研究蛋白質之間相互作用的經典方法。
通俗點來說,假設我們需要研究樣品中A蛋白和B蛋白之間是否存在一些相互作用,首先我們通過合適的方法處理樣本,將蛋白提取出來(同時不能破壞蛋白之間的相互作用),然后用預先結合了瓊脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗體捕獲樣本中的A蛋白,那么與A蛋白結合的B蛋白也能一起沉淀下來。再將蛋白從珠子上裂解下來,對B蛋白進行檢測,能檢測到,說明B蛋白在之前的沉淀過程中隨著A蛋白一起被拉下來了,進而證明二者之間存在相互關系。
How to do?
A few tips:
各名稱解析:
IB:全稱immunoblotting,即免疫印跡,也就是常規的Western Blotting,用于顯示目的蛋白。
IP:全稱immunoprecipitation,即免疫沉淀,這一步主要是為了純化富集目的蛋白。
Input:全細胞裂解液,含有細胞內所有的蛋白,可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞裂解液,在做IP實驗之前,需要先跑WB,確認樣本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗體
IgG:Anti-A的同型對照抗體,即跟Anti-A同來源同種型,如Anti-A是兔來源IgG型,則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG(abs20035)
結果圖解析:
該結果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組:Input組及IP組,其中IP組又分為IgG組(陰性對照組)和實驗組,并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結論:蛋白A與蛋白B都是存在的,證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗,結果蛋白A與蛋白B均沒有條帶,說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來,證明蛋白A和B與IgG沒有結合,排除了蛋白與抗體非特異性結合的可能性;而實驗組蛋白A和B均有條帶,表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗,成功把蛋白A沉淀下來了,與此同時蛋白B也被沉淀下來,進而得到結論:蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。
確切來說,試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應,而實際上免疫共沉淀實驗需要設置多個組別進行對照驗證,因此具體能夠完成多少次Co-IP實驗由設計方案決定,一般至少需要設置陰性對照、陽性對照、實驗組三個組別。
這個步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結合的蛋白質,減少干擾,非必做,如CoIP實驗中發現有較多雜帶,可考慮做一下;但應注意,選擇此步驟后,需要消耗瓊脂糖珠,后續能夠進行免疫沉淀的次數也相應減少。
※ 出現假陽性結果該怎么排除?
可能出現假陽性結果的成因 | 對照組設置 |
瓊脂糖珠與X蛋白發生非特異結合 | 瓊脂糖珠+抗體X+抗體Y |
瓊脂糖珠與Y蛋白發生非特異結合 | 瓊脂糖珠+蛋白Y |
抗體X和目的蛋白Y非特異性結合 | 瓊脂糖珠+抗體X+蛋白Y |
抗體的非特異性結合 | IgG+蛋白X+蛋白Y |
對于內源性Co-IP實驗,陰性結果不能說明無相互作用,也有可能是蛋白在細胞內表達過低導致,因此建議先做過表達Co-IP作為對照。
貨號 | 品名 | 規格 | 貨期 |
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abs9146 | PMSF | 5g/25g/100g | 現貨 |
abs9116 | Lysis Buffer for WB/IP Assays | 100ml | 現貨 |
abs9239 | Lysis Buffer for WB/IP Assays (Without Enzyme Inhibitors) | 100ml | 現貨 |
abs20035 | Rabbit IgG | 10mg | 現貨 |
abs20038 | Mouse IgG | 1mg | 現貨 |
abs9232 | BCA蛋白定量試劑盒 | 500次 | 現貨 |
abs9389 | BIS-Tris Gels 預制膠10%, 10 wells | 10片/盒 | 現貨 |
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abs950 | 10*電轉液 | 1L | 現貨 |
abs954 | WB專用一抗二抗稀釋液 | 100ml | 現貨 |
abs961 | 10×PBS緩沖液 | 500ml | 現貨 |
abs952 | 10*TBST | 1L | 現貨 |
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