穩定mRNA降低免疫原性的神器—修飾核苷酸

更新時間：2022-05-06 點擊次數：1476

信使 RNA (mRNA) 等外源性分子介導的生物療法，其應用面臨的一個主要障礙就是其免疫原性，因為體外合成的 mRNA 具有較高的免疫原性，可能會誘發大量炎癥反應，不僅無法取得預期的治療效果，還會引起強大的副作用。關于如何降低體外合成mRNA分子的免疫原性，在過去的十幾年中，科學家們進行了大量相關研究，其中，較為重要的發現之一就是多種修飾核苷酸，而含有各種修飾核苷酸的 mRNA，如假尿苷和N-6-甲基腺苷，可以有效降低mRNA的免疫原性，抑制先天免疫激活，使 mRNA可能成為再生醫學、疾病治療和細胞重編程的有力工具。

迄今為止，已經發現并驗證的多種核苷酸化學修飾策略可以降低免疫原性而不影響其翻譯特性，例如將天然腺苷替換為N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）；替換天然胞嘧啶核苷為5-甲基胞嘧啶核苷（m5C）；以及將天然尿苷替換為5-甲氧基尿苷（5moU），假尿苷（ψ）或N1-甲基假尿苷（m1ψ）等。其中，m5C和ψ備受關注，因為無論是體內還是體外都表明，它們在有效降低mRNA免疫原性的同時，也顯著提高了其翻譯效率。

圖1：mRNA的化學修飾匯總[1]

一、核苷酸修飾簡介

1、Pseudo-UTP (Ψ)

假尿苷（Pseudouridine）是RNA上豐富的修飾核苷，又被稱為RNA的“第五種核苷"。mRNA 假尿嘧啶化修飾的過程是由假尿嘧啶合成酶進行催化，讓尿嘧啶核苷酸（U）化學結構發生改變，形成假尿嘧啶核苷酸。已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。2005年，Katalin Karikó等人發現將假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性隨著假尿苷引入比例的增高而降低[2]。2008年，Katalin Karikó等人還發現用假尿苷*替代尿苷的mRNA不僅能極大地降低mRNA的免疫原性，還能提高mRNA的穩定性并增強其翻譯能力[3]。

2、N1-Methylpseudo-UTP (mΨ)

N1-methyl-pseudouridine 是一種甲基假尿苷，通過增加核糖體密度，mRNA 中的 N1-methyl-pseudouridine 以 eIF2α 依賴性和獨立機制增強翻譯。2015年，Oliwia Andries等人發現用N1-甲基假尿苷*替代尿苷比用假尿苷*替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強mRNA的蛋白表達能力[4]。

3、N6-Methyl-ATP（m6A）

早在 20 世紀 70 年代，科學家們就在 RNA 中發現了 m6A 修飾，但其功能則由于技術制約一直未能被很好的揭示。直到 2012 年，科學家們的研究表明，m6A 修飾和mRNA 的穩定性、剪接加工、翻譯以及 microRNA 的加工有關[5,6]。 2018年，Shinichiro Akichikade等人還發現在5'-加帽的mRNA帽子上含有92% 的m6Am和8%的Am，可促進mRNA的翻譯[7]。

4、5-Methyl-CTP (5mC)

在 mRNA 中，m5C 修飾連同多種效應酶，例如 NOP2/Sun RNA 甲基轉移酶 2 (NSUN2)、NSUN6,38 tRNA 天冬氨酸甲基轉移酶 1 (TRDMT1) 和 Aly/REF 輸出因子 (ALYREF)，執行多種功能，包括促進 mRNA 核胞質運輸；病毒蛋白表達； DNA損傷修復；mRNA 穩定性；細胞耐受性、增殖和遷移；干細胞的發育、分化和重編程； mRNA 剪接的調控[8]。此外，m5C的分布因細胞類型而異。在mRNA的特定位置上的m5C修飾表現出不同的調控活性:它們可以促進或抑制翻譯[9]。

5、5-Methoxy-UTP(5moU)

5-甲氧基尿苷(5moU) 是一種罕見的核苷，存在于tRNA中。它由β- D-核糖尿嘧啶（糖）和核堿基 5-甲氧基尿嘧啶組成，是尿苷的衍生物。RNA (mRNA) 中加入 5-甲氧基尿苷可以降低所得mRNA 的免疫原性。2022年，Hanieh Moradian等人發現尿苷的化學修飾，特別是5moU，顯示出高水平的蛋白質產生，而對炎性巨噬細胞反應的誘導可忽略不計[10]。

二、核苷酸修飾應用案例

圖2：mRNA的化學修飾能夠顯著改善表達，但因細胞類型和編碼序列而異[1]

核苷酸修飾類型	功能/應用
Ψ、mΨ[11]	用N1-甲基假尿苷替代尿苷比用假尿苷替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強mRNA的蛋白表達能力
mΨ[12,13]	Moderna 疫苗（mRNA-1273）和BioNTech 疫苗（BNT162b）
m6A、Ψ、mΨ、2FdU、5mC、5hmC、5moC和2 2FdC[14]	與未修飾的 mRNA 相比，具有修飾核苷酸的每種 mRNA 減少了 IFN-β 的產生, 逃避或抑制先天性免疫信號
ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU[15]	五種修飾的FLuc mRNA（ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU-FLuc mRNA）顯著優于未修飾的 FLuc mRNA 的活性。
Mψ、5moU、ψ[16]	mRNA的化學修飾能夠顯著改善蛋白質表達，這取決于細胞類型和編碼序列。具有mψ、5moU和ψ修飾的eGFP mRNAs在測試的細胞系中表達前三。5moU 修飾的 eGFP mRNA 比其他 eGFP mRNA更穩定。

愛必信提供以下幾種修飾核苷酸

修飾堿基	類型	特點
	假尿苷（Pseudo-UTP；Ψ）、	提高mRNA的穩定性、提升翻譯效率、降低免疫原性
	N1-甲基-假尿苷（N1-Methylpseudo-UTP）
	5-甲基-胞苷三磷酸（5-Methyl-CTP）
	5-甲氧基-尿苷三磷酸(5-Methoxy-UTP)
	N6-甲基-腺苷三磷酸(m6A,N6-Methyl-ATP)

修飾核苷酸產品列表

貨號	名稱	規格
abs60188	5-甲氧基-CTP鋰鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60169	5-甲氧基-UTP鈉鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60189	5-甲氧基-UTP鋰鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60168	5-甲基-CTP鈉鹽溶液	10μL/50μL/1mL
abs60159	ATP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60163	CTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60164	GTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60165	UTP Sodium salt solution（100mM）	1ml×3
abs60186	N1-甲基-假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60156	N1-甲基-假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60187	N6-甲基-ATP鋰鹽溶液	10ul/50ul
abs60158	NTP 鈉鹽混合溶液（含ATP、CTP、GTP、UTP）	1ml×3
abs60185	假尿苷三磷酸四鋰鹽溶液/Pseudo-UTP, lithium salt solution	10ul/50ul/1ml
abs60155	假尿苷三磷酸四鈉鹽溶液/Pseudo-UTP, Sodium salt solution	10ul/50ul/1ml

[1] Xiao, Dong, Yizhou. Effects of Chemically Modified Messenger RNA on Protein Expression. Bioconjug Chem. 2016 Mar 16;27(3):849-53.

[2] Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H., & Weissman, D. (2005). Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity, 23(2), 165–175.

[3] Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F. A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., & Weissman, D. (2008). Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, 16(11), 1833–1840.

[4] Andries, O., Mc Cafferty, S., De Smedt, S. C., Weiss, R., Sanders, N. N., & Kitada, T. (2015). N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 217, 337–344.

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[10] Moradian H , Roch T , Anthofer L , et al. Chemical modification of uridine modulates mRNA-mediated proinflammatory and antiviral response in primary human macrophages.

[12] Andries, O., Mc Cafferty, S., De Smedt, S. C., Weiss, R., Sanders, N. N., & Kitada, T. (2015). N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 217, 337–344.

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[15] Durbin AF, Wang C, Marcotrigiano J, Gehrke L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. mBio. 2016 Sep 20;7(5):e00833-16. doi: 10.1128/mBio.00833-16.

[16] US20200172935A1

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