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| 根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的《2021中國癌癥報告》，2021年，全國惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)380.4萬例，相當(dāng)于平均每天超過1萬人被確診為癌癥，每分鐘有7個人被確診為癌癥。 面對逐年增長的癌癥患者數(shù)量，腫瘤成為研究學(xué)者不斷攻堅的對象，迫切希望找到更好的治療方式。美國的Bruce A. Beutler、盧森堡的Jules A. Hoffmann以及加拿大的Jules A. Hoffmann三位科學(xué)家因在免疫學(xué)方面的發(fā)現(xiàn)獲得2011年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，他們革新了我們對免疫系統(tǒng)的認識，為疾病的治療開辟了新的方式。 免疫治療成為對癌癥治療的新型治療手段。其中，CAR-T（Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy）在白血病和淋巴瘤患者身上取得了巨大的臨床成功，導(dǎo)致該領(lǐng)域的研究呈指數(shù)級增長。 2021年，國內(nèi)CAR-T產(chǎn)品上市，標價120萬人民幣。此前國際上已有多款CAR-T的藥物上市，價格也均十分高昂。
CAR-T上市產(chǎn)品這里，小編想給大家分享2021年3月發(fā)表于Nature雜志上的一篇影響因子高達53分的文章，接下來小編帶大家一起看看吧。 Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells  本篇文章給大家展示了過去3年中嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞在功效和安全性等方面的主要進展和變化，CAR的各種分子模塊如何影響信號傳導(dǎo)和功能，在CAR-T治療過程中會發(fā)生的毒副作用以及如何干預(yù)以一定程度的降低毒副作用。 接下來我們一起沿著文章的思路去看看吧。 1、CAR-T的結(jié)構(gòu) CAR-T治療又稱嵌合抗原受體T細胞治療，是將人的T細胞經(jīng)過基因工程手段體外修飾改造后，從而可特異性識別和結(jié)合腫瘤細胞表面的抗原并實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性殺傷，將其回輸患者體內(nèi)，用于治療疾病。  圖1 CAR-T細胞治療 （圖1引自The application of CAR-T cell therapy in hematological malignancies: advantages and challenges） CAR-T之所以有這么強大的功能，被用于治療各種疾病，主要在于它的結(jié)構(gòu)。嵌合抗原受體T細胞是抗體的單鏈可變區(qū)域（scFv)與T細胞表面受體嵌合于T細胞上，主要由三部分組成，即胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)域。胞外區(qū)常為單鏈抗體（scFv)，負責(zé)識別并結(jié)合靶抗原；跨膜區(qū)是鉸鏈或間隔區(qū)，可將scFv錨定于細胞膜上；胞內(nèi)信號域由共刺激因子和CD3信號域組成。當(dāng)抗原被識別和結(jié)合后，產(chǎn)生刺激信號傳至胞內(nèi)信號域，T細胞被激活并發(fā)揮效應(yīng)功能。  圖2 CAR-T的結(jié)構(gòu) 沒有什么事情是一蹴而就的，CAR-T的結(jié)構(gòu)也是在不斷進步和完善過程中。最早出現(xiàn)的CAR被稱為第一代CAR，僅由一個胞內(nèi)信號域組成。然而，由于它的結(jié)構(gòu)中缺乏細胞增殖的第二信號，導(dǎo)致由它介導(dǎo)的T細胞特異性結(jié)合腫瘤抗原后無法進行進一步的增殖，因此，第一代CAR的抗腫瘤作用很弱，在體內(nèi)作用時間很短，最終導(dǎo)致T細胞的凋亡。 因此研究人員嘗試設(shè)計改造CAR受體，在第一代的基礎(chǔ)上成功設(shè)計出第二代CAR，增加了一個共刺激信號的活性結(jié)構(gòu)域。隨著共刺激信號域的加入，T細胞上的第二刺激信號被激活，上游的信號從而被無限擴大，從而促進T細胞的增殖，白介素IL-2的合成和表達，部分抗凋亡蛋白的分泌。也就是說，CART細胞在殺死腫瘤細胞的同時，也實現(xiàn)了其自身的無限擴增。然而卻發(fā)現(xiàn)在外源的共刺激信號不存在時，上述作用均無法正常進行。 為了進一步優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)，研究人員開始著眼于第三代CAR的開發(fā)，在包含胞內(nèi)信號域、共刺激信號活性結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，增加了額外的共刺激信號。而第三代CAR-T細胞的體內(nèi)擴增能力、殺傷能力及細胞因子釋放能力均明顯提高。  圖3 第一代至第三代CAR-T （圖3引自Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy） 第一代CAR只有一個激活域，胞外抗原識別區(qū)即單鏈可變片段（scFv）融合跨膜區(qū)和T細胞受體（TCR）CD3ζ分子胞內(nèi)信號域組成； 第二代CAR包含一個共刺激域，其衍生自CD28或4-1BB結(jié)構(gòu)域，位于跨膜區(qū)和CD3信號傳導(dǎo)域之間； 第三代CAR具有一個激活域和兩個共刺激域。 胞外域由抗體衍生的抗原結(jié)合 scFv（單鏈可變片段）與重鏈可變片段 VH 和輕鏈可變片段 VL 組成，它們通過接頭連接。鉸鏈區(qū)將 ScFv 與跨膜連接領(lǐng)域。 內(nèi)域由共刺激域（CD28；CD137 或 4-1BB）和激活域組成：CD3 zeta。 最新的研究表明CAR-T細胞的活性與靶細胞提供的內(nèi)源性受體也有一定的關(guān)系，特別是當(dāng)它們產(chǎn)生額外的蛋白質(zhì)分子，如細胞因子，或擁有額外的受體，如共刺激配體時，因此CAR的結(jié)構(gòu)也是在不斷的完善過程中。 那了解了CAR-T的進化史接下來我們一起來看看它的生產(chǎn)過程吧。 2、CAR-T的生產(chǎn) CAR-T細胞的生產(chǎn)過程包括T細胞的初始分離和富集，CART細胞制備，包括T細胞活化，T細胞擴增，使用病毒或非病毒載體進行CAR載體的基因轉(zhuǎn)移。病毒載體系統(tǒng)，然后離體CART細胞擴增。最終的細胞產(chǎn)物需要進行后期處理和質(zhì)量控制測試，測試通過之后進行回輸。 T細胞的初始分離和富集一般是從外周血單核細胞（PBMC）獲得，通常可以采用Ficoll密度梯度離心法用于去除粒細胞，紅細胞和血小板，最終獲得T細胞。 在CART制備過程中T細胞活化和擴增是不可少的步驟。最佳激活應(yīng)導(dǎo)致足夠的T細胞擴增，而不會引起巨大的T細胞分化或激活誘導(dǎo)的細胞死亡。常見的是使用抗CD3/抗CD28抗體包被的磁珠作為人工抗原呈遞顆粒來激活T細胞。抗CD3抗體可提供強大的增殖信號，而抗CD28抗體則可提供有效的共刺激信號。此外，T細胞通常在 IL-2存在的情況下生長，IL-7和IL-15等細胞因子也被用在T細胞的培養(yǎng)中。在IL-2存在的情況下，離體T細胞的擴增會導(dǎo)致更加分化和疲憊的表型，并且會降低T細胞的持久性。與IL-2相比，IL-7/IL-15的擴增顯示出增強的激活和增殖作用。 擴增好的T細胞需要將相應(yīng)的遺傳信息轉(zhuǎn)移到細胞中，CAR構(gòu)建物通過病毒或非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體都被認為是安全有效的，它們都可以隨機整合到宿主T細胞基因組中。用非病毒載體電穿孔細胞是一種成本比較低的基因轉(zhuǎn)移方法，但安全性和有效性仍在評估中。一些CAR-T細胞的制造現(xiàn)在包括CRISPR Cas9或轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶(TALENs) 的基因編輯，它可以與腺相關(guān)病毒載體結(jié)合使用，將CAR-T細胞整合到一個特定的位點。 接下來就是構(gòu)建好的T細胞在離體的條件下進行擴增然，最終的細胞產(chǎn)物需要進行后期處理和質(zhì)量控制測試，測試通過之后進行回輸。 3、CAR-T細胞治療的毒副作用 迄今為止，CAR-T細胞免疫療法在白血病和淋巴瘤等血液腫瘤領(lǐng)域取得了重大突破，被認為是最有潛力攻克癌癥的療法之一。2017年FDA先后批準了僅有的兩個CAR-T細胞療法商業(yè)產(chǎn)品：諾華的Kymriah（淋巴瘤）與吉利德的Yescarta（白血病），對癌癥的治療帶來了巨大的改變。雖然這種*生物療法可以使某些晚期癌癥患者的病情得到長期緩解，但是相較于同為免疫療法的免疫檢查點抑制劑，阻礙其發(fā)展的最大絆腳石就是毒副作用。CAR-T細胞免疫療過程中臨床常見的毒性反應(yīng)包括細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒性（NT）。CAR-T細胞相關(guān)毒副反應(yīng)的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括CAR結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)方式、預(yù)處理方案、細胞劑量、腫瘤類型及腫瘤負荷等。 CRS和神經(jīng)毒性都歸因于分泌細胞因子的T細胞的快速激活和擴張。目前的理解是，CAR - T細胞分泌的細胞因子和/或配體受體相互作用激活骨髓間室的額外免疫細胞，從而釋放更多的細胞因子，創(chuàng)造一個激活炎癥的循環(huán)，稱為細胞因子風(fēng)暴。在病人體內(nèi)自然產(chǎn)生的腎上腺素也被證明有助于這種自我放大的生產(chǎn)環(huán)。盡管神經(jīng)毒性在臨床上與CRS有關(guān)，但其機制似乎不同。 在識別腫瘤抗原后，抗腫瘤反應(yīng)激活下游嵌合抗原受體T細胞，并激活可分泌炎性細胞因子(如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF和IFNγ)的固有免疫細胞。IL-1和IL-6的釋放導(dǎo)致巨噬細胞中自我放大的炎癥激活循環(huán)。促炎細胞因子的增加可能激活了腦血管中的內(nèi)皮細胞，從而導(dǎo)致該區(qū)域通透性增加和毛細血管滲漏(稱為血管源性水腫)，表現(xiàn)為局灶性水腫和神經(jīng)毒性。最近的一項研究提出的另一種可能的解釋是，腦壁細胞也表達CD19，靶向CAR - T細胞對這些細胞的活性導(dǎo)致了神經(jīng)毒性。 在這種反應(yīng)的不同階段進行治療干預(yù)可以減輕神經(jīng)毒性和細胞因子釋放綜合征(CRS)。  Fig4 細胞因子風(fēng)暴和神經(jīng)毒性的分子認識和治療干預(yù) 識別腫瘤抗原后，嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞下游激活的抗腫瘤反應(yīng)由于粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、腫瘤壞死因子 (TNF) 和干擾素等炎性細胞因子的分泌而導(dǎo)致先天免疫細胞的激活 -γ（干擾素γ）。 這導(dǎo)致巨噬細胞中的自我放大炎癥激活環(huán)導(dǎo)致白細胞介素-1 (IL-1) 和 IL-6 的釋放。 在該反應(yīng)的不同階段進行治療干預(yù)可以減輕神經(jīng)毒性和細胞因子釋放綜合征 (CRS)。 針對GM-CSF（lenzilumab）、IL-6受體（tocilizumab）和IL-1受體（anakinra）的治療已在臨床上用于此目的。 酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼影響 T 細胞信號傳導(dǎo)以降低 CRS，而甲酪氨酸抑制巨噬細胞炎癥激活以達到類似的效果。 常見的干預(yù)措施有： 干預(yù)細胞因子，抗體阻斷IL-1、IL-6和GM-CSF，阻斷過度炎癥反應(yīng)； 控制T細胞的過度激活，采用酪氨酸激酶抑制劑，阻斷激活信號傳導(dǎo)； 化學(xué)藥物阻斷細胞因子的過度釋放，采用甲胺酸阻斷兒茶酚胺樣作用。 除毒副作用外，CAR-T治療過程中也會產(chǎn)生抗性的問題，那針對抗性要怎么解決呢，我們一起往下看。 4、CAR-T的耐性和抗性問題 CD19突變的選擇性壓力是抗原丟失最常見的機制，盡管CD19的突變是最常見的，但并不是抗原丟失的記錄機制。有進一步的研究表明，腫瘤細胞來自一個白血病B細胞，該細胞在制造過程中被CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)。CAR分子掩蓋了細胞表面的CD19，阻止了它被CAR - T細胞識別。這個發(fā)生的概率雖然很小，但也嚴重影響生產(chǎn)安全。除了CD19的*丟失，Hamieh等人報道了抗原丟失的第三種機制，這解釋了低抗原腫瘤逃逸是如何發(fā)生的。通過一種叫做吞噬作用的過程，CARs從腫瘤細胞中移除目標抗原并將其內(nèi)在化，導(dǎo)致腫瘤細胞上的抗原密度降低。 根據(jù)機制的不同可分為抗原依賴性和非抗原依賴性兩方面。對不同原因?qū)е碌目剐裕闹幸蔡岬搅瞬煌慕鉀Q措施。 （1）抗原依賴性導(dǎo)致原因： 靶抗原丟失（ 指CAR分子能夠從腫瘤細胞上移除目標抗原，并將其內(nèi)化，降低腫瘤細胞上的抗原密度）； 靶抗原的基因突變導(dǎo)致靶標不能被有效識別； 靶抗原表位被遮蔽。 針對這些情況目前也找到了對應(yīng)的解決措施： 設(shè)計多靶向的CAR分子； 增加靶抗原的表達； 提高scFv與靶抗原的親和力，可能有助于CAR-T細胞識別低密度的靶抗原。 （2）非抗原依賴性導(dǎo)致原因： T細胞表面死亡受體缺失，造成T細胞過度耗竭； 腫瘤細胞表面配體分子缺失，如FAS相關(guān)死亡蛋白（FADD）、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體-2（TRAIL-2）的缺失使腫瘤細胞在體外和體內(nèi)對CAR T細胞更具抵抗作用。 針對非抗原依賴性解決措施： 阻斷免疫抑制檢查點，阻止T細胞耗竭，可修飾CAR-T細胞上的PD-1分子，在細胞表面表達PD-1的顯性負性受體或采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除T細胞上PD-1的基因； 提高CAR-T細胞的增殖能力、持久性和抗瘤活性，可在CAR-T細胞上表達IL-7受體； 改變T細胞終末狀態(tài)的分化，研究表明過表達c-Jun AP1轉(zhuǎn)錄因子可以降低T細胞耗竭。 在CAR - T細胞治療領(lǐng)域的大多數(shù)經(jīng)驗是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的環(huán)境中，腫瘤微環(huán)境(TME)被認為在反應(yīng)中發(fā)揮的作用微乎其微。然而，隨著該領(lǐng)域從靶向cd19的CAR-T細胞轉(zhuǎn)向?qū)嶓w腫瘤，抑制TME也可能產(chǎn)生對CAR - T細胞治療的耐藥性。這對于難以穿透、高度免疫抑制的實體惡性腫瘤，如膠質(zhì)母細胞瘤或胰腺癌等來說值得倍加關(guān)注。缺乏趨化因子來吸引CAR-T細胞，不正常的血管系統(tǒng)和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的癌癥相關(guān)成纖維細胞都使得CAR - T細胞難以進入腫瘤。一旦出現(xiàn)這種情況，免疫抑制細胞和細胞因子，包括Treg細胞、骨髓來源抑制性細胞（MDSC）、TGFβ、IL-6、IL-10和前列腺素e2都會抑制CAR - T細胞的增殖和效應(yīng)功能。 針對這種情況目前可以通過一下兩種方法解決： （1）增強CAR-T細胞的浸潤能力，可過表達IL-7和CCL-19； （2）改變Treg介導(dǎo)免疫抑制作用。  圖5 抗原依賴性和抗原非依賴性抗性機制 對嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞療法的抗性可根據(jù)抗原丟失或保留的情況進行分類。抗原丟失最常見的原因是編碼抗原本身的基因發(fā)生突變。然而，由于腫瘤細胞的意外轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致腫瘤抗原的“CAR掩蔽”，導(dǎo)致抗原丟失，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。此外，腫瘤抗原水平降低可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)，這可能是由于吞噬作用，其中T細胞上的CAR分子從表面去除腫瘤抗原，將其內(nèi)化并開始自身表達腫瘤抗原。抗原非依賴性抗性是由于T細胞耗盡。這可能是由于具有終末效應(yīng)表型的次優(yōu)輸注產(chǎn)品、腫瘤細胞上的死亡受體信號丟失使其對 CAR T 細胞殺傷具有抗性，或者由于 CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性 T 細胞（Treg 細胞）和骨髓衍生的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境所致抑制細胞（MDSC）及其各自的可溶性因子。 5、CAR-T的研究進展 （1）新的治療靶點和治療產(chǎn)品 經(jīng)過不斷的技術(shù)改進和嚴格的臨床監(jiān)護管理目前已經(jīng)可以有效的控制CAR-T的副反應(yīng)，CAR-T療法治療癌癥的數(shù)量逐漸增多；CAR-T在白血病、淋巴瘤等血液類疾病中臨床表現(xiàn)良好，但在血液腫瘤相關(guān)領(lǐng)域靶點扎堆的現(xiàn)狀也是需要突破的瓶頸之一。目前針對多發(fā)骨髓瘤也有了GPRC5D（G蛋白偶聯(lián)受體）、CD38、CD138、SLAMF7等新靶點，腦瘤有了氯毒素肽、EGFRvIII、HER2等靶點的突破。 此外，某些特定T細胞亞群修飾的CAR-T細胞可能會產(chǎn)生較好的效果。目前，CAR-T的生產(chǎn)是使用來自患者的異質(zhì)T細胞(CD4 + T細胞和CD8 + T細胞在某些情況下除外)。然而，有研究表明，某些T細胞亞群可能效果更好。臨床試驗中已經(jīng)使用了中心記憶T細胞生產(chǎn)基于CD28的CD19靶向的CAR T細胞。初步結(jié)果表明，這些細胞是有效的，雖然與批量生產(chǎn)的CD19靶向的CAR - T細胞相比不一定具有持久性。 與此同時，CD26高表達的CAR-T細胞也在進一步研究中，由于其能夠產(chǎn)生IL-17A、IFN-γ、IL-2和IL-22，細胞表面表達CCR2和CCR5，具記憶干細胞樣特性，它們在實體腫瘤模型中有*的功能。 γδ T細胞是另一個潛在的有利亞群。γδT細胞能耐受T細胞耗竭，其表面抑制性受體（TIM3和PD-1）表達水平較低，同時表達共刺激和抗原呈遞分子（CD86 和人類白細胞抗原-DR (HLA-DR)），并已被證明可將腫瘤抗原交叉呈遞給TME中的其他 T 細胞。  圖6 細胞亞群的選擇 與傳統(tǒng)的CAR T細胞相比，CD26高表達的CAR T細胞增加了細胞因子的產(chǎn)生，更類似于干細胞的表型和較強的細胞運輸能力。 與傳統(tǒng)的CAR T細胞產(chǎn)品相比，具有內(nèi)源性γδ T細胞受體的CAR T細胞耗竭減少，共刺激增加。 （2）通用型細胞治療 結(jié)合各種情況看通用型細胞治療是未來發(fā)展的方向，其主要難點是GvHD宿主抗移植物反應(yīng)。宿主抗移植物反應(yīng)與TCR上HLA基因相關(guān)。通用的CAR細胞治療，一種思路是編輯修飾相關(guān)基因，如TALEN基因編輯的TCR-α基因或者CRISPR-Cas9基因編輯敲除TCR上的HLA基因；另一種思路是設(shè)計CAR分子，zipper-CAR系統(tǒng)通過zipper蛋白的受體和配體橋接scFv和CAR分子胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，通過更換不同的scFv設(shè)計靶向多抗原的通用CAR。  圖7 通用型CAR-T系統(tǒng) 單鏈可變片段 (scFvs) 可以切換以同時靶向新抗原或多個抗原，并且可以改變拉鏈結(jié)合親和力以調(diào)整CAR信號的強度以獲得適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。門控策略也可以通過在不同的分子上具有CD3ζ信號域和共刺激域來使用，因此兩個相應(yīng)的抗原都必須存在才能具有*的CAR激活。 （3）CAR-X細胞 CAR-T細胞療法陸續(xù)面世的同時，關(guān)于CAR-T的討論也開始轉(zhuǎn)向更加充滿想象空間的“CAR-X”新型細胞療法，包括CAR-巨噬細胞（CAR-M）療法、CAR-自然殺傷（NK）療法、CAR-Treg細胞療法、 CAR γδ-T細胞療法等。  圖8 新型CAR細胞設(shè)計 CAR-NK細胞：NK細胞是自然殺傷細胞，具有天然的抗腫瘤作用。其優(yōu)點是無MHC限制性，安全性較高，可制備同種異體細胞，CAR-NK是通用型細胞治療一個比較好的選擇。臍帶血CAR-NK細胞在體外具有細胞毒性，在體內(nèi)具有持久性和抗腫瘤作用。關(guān)于毒性，這些CAR-NK細胞具有化學(xué)誘導(dǎo)的caspase 9基因，可以通過體內(nèi)治療消除。 CAR-Ms巨噬細胞：巨噬細胞具有抗原特異性吞噬和促炎極化作用，能交叉遞呈抗原并激活T細胞。研究表明，CAR-M巨噬細胞在小鼠肺癌轉(zhuǎn)移模型中展示了較強的抗腫瘤活性。在人源化小鼠中，CAR-Ms增強了T細胞抗腫瘤反應(yīng)，單細胞RNA測序表明其誘導(dǎo)了促炎性腫瘤微環(huán)境。 CAR-Treg細胞：CD4 + CD25 +調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)能夠分泌免疫抑制分子TGFβ, IL -10, IL-35，可用于治療自身免疫性疾病和移植的排斥反應(yīng)，也可防止T細胞過度激活。可作為自身免疫性疾病和移植的潛在療法。 CAR-T細胞研究之前迅速進入臨床，因其可能產(chǎn)生的副作用又回到了試驗臺，試驗結(jié)果提供了新的功效、毒性和耐藥性機制，并促進了對新靶點的探索，信號機制的闡明和新技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。在CAR分子設(shè)計、轉(zhuǎn)導(dǎo)方法和選擇最佳細胞類型方面的創(chuàng)新可能會帶來新的突破，改變未來對許多不同腫瘤的治療方式，細胞治療方式未來可期。 最后小編給大家做好了整個CAR-T流程的梳理以及整個過程中會用到的產(chǎn)品，有需要的老師可以隨時聯(lián)系愛必信哦！  Absin提供相關(guān)科研試劑，全部現(xiàn)貨，可提供大包裝，助力您的CAR-T研究！
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