細胞被支原體污染后會引起：

細胞生長特征的改變，細胞代謝的抑制；

核酸合成的破壞，染色體畸變；

細胞膜抗原性的改變，并可能改變轉染率和病毒敏感性。

但是細胞的生長率一般并未發生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。

因此支原體的定期檢測、及早發現及清除對細胞培養尤其是非常重要的細胞極為重要。

3.支原體檢測方法

細胞培養中有幾種不同的技術可以識別是否被支原體污染，分別是分離培養法，DNA熒光染色檢測法，ELISA檢測法，PCR檢測法和支原體特異酶檢測法。為給大家提供一個選擇參考，小優這就詳細介紹下這幾種方法的優缺點。

分離培養法

操作方法：

從可疑的細胞培養體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上快速生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。

分離培養法是支原體檢測的金標準方法，基本不會出現假陰性結果，其檢測精確度最高，具有高度的特異性和敏感性，可檢測絕大多數支原體種類。但支原體雖能在人工培養基上生長，但對培養基的營養要求較高，培養基較為復雜。而且檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間，若檢測到有支原體，細胞的污染范圍也已經擴大了，現在用此方法檢測的比較少。

 
DNA熒光染色檢測法

操作方法：

1、細胞樣品的準備： 

（1）對于貼壁細胞，在六孔板或其它多孔板內或蓋玻片上培養細胞至 50%-80%。細胞培養過滿會導致很難判斷是否存在支原體污染。 

（2）對于懸浮細胞，離心沉淀細胞，取少量細胞做細胞涂片，空氣中充分晾干。 

2、用 PBS 按照 1:10 稀釋 Hoechst 染色液(1 體積 Hoechst 染色液加入 9 體積 PBS)。稀釋后的 Hoechst 染色液宜在 24h 內使用。 

3、加適量固定液固定 10~20min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對細胞進 行洗滌。對于貼壁細胞，固定前需去除培養液。 

4、去除固定液，空氣中晾干。 

5、加適量 10 倍稀釋的 Hoechst 染色液室溫染色 10~30min。 對于六孔板的一個孔，加入 1mL 染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時注意避光。可以用鋁箔紙避光。 

6、去除染色液，空氣中晾干。 

7、滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍色熒光。 熒光顯微鏡觀察時需 400 倍或 1000 倍放大觀察(需使用油鏡)。 沒有支原體污染或其它原核生物污染的細胞樣品，僅觀察到細胞核的藍色熒光，線粒體 DNA 不會被染色。 

有支原體污染的細胞樣品可觀察到細胞核周圍微粒狀或絲狀藍色熒光。 支原體污染嚴重的細胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍色熒光。

培養細胞中的細菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光學顯微鏡下可見，但支原體污染在光學顯微鏡下不可見，通過Hoechst染色來檢測支原體，可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。但是Hoechst 染色試劑對人體有害，要注意防護；且固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，需要在通風櫥內進行固定操作；熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。

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ELISA檢測法

以ELISA法為基礎的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，也有一些商品化的支原體elisa試劑盒來檢測培養物中是否含有支原體。不過這種方法相對復雜市面上用的也比較少。

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PCR檢測法

PCR法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，可擴增樣品中DNA的特定序列，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。

PCR檢測法是一種靈敏而快速的方法，可以在4.5 h–1天內識別細胞培養物中的支原體污染，在細胞培養實驗室也廣泛使用。但是，存在在測試過程中將污染物從陽性對照（或以前對支原體測試呈陽性的任何樣品）傳播到未受影響的樣品的風險，從而導致假陽性結果，許多商品化的試劑盒也無法檢測所有種類的支原體。另外PCR的擴增會被細胞的代謝產物抑制，需要用DNA提取試劑盒進行DNA提取后再進行鑒定。 

支原體特異酶檢測法

操作方法：

1、取2mL培養基上清（建議培養48小時以上），200g離心5分鐘，去除細胞和細胞碎片；

2、取100μL上清，加入100μL裂解試劑（MycoAlert PLUS Reagent，含裂解試劑、熒光素酶、熒光素），裂解支原體；

3、室溫22℃（不超過25℃）孵育5分鐘，檢測背景ATP，測量發光值得到讀數A（Reading A）；

4、加入100μL支原體酶特異性底物（MycoAlert PLUS Substrate）；

5、室溫孵育10分鐘，測量發光值得到讀數B（Reading B），計算B/A比值。

若B/A比值小于0.9則為支原體陰性，若B/A比值大于1.2則為支原體陽性，若介于兩者之間則為結果可疑，需要繼續培養24h后復檢。

支原體特異酶檢測法主要是Lonza品牌的MycoAlert™方法，首先溶解支原體細胞，釋放其酶。這些酶與試劑盒中的底物發生反應，催化ADP向ATP的轉化。螢光素酶使用此ATP來創建光信號，然后可以使用發光計對其進行檢測，通過檢測底物加入前后讀數的比值，可判斷樣本中是否含有支原體。

該法為化學發光，操作簡單，無需提取DNA，快速檢測，20分鐘內出結果，具有較高的靈敏度、特異性及相對較高的準確性，已驗證可檢測至少44種支原體，包含細胞培養中常見的6種支原體（口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾原體、發酵支原體、唾液支原體，占支原體污染的95%），既可以檢測新鮮樣本也可以檢測凍存樣本，可以視為常規微生物培養和DNA熒光染色法的替代方法。

測定方法必然是高靈敏、高特異性且快速的。但目前沒有一種非常好的檢測方法可以單槍匹馬把實驗室污染細胞的八種主要支原體都檢測出來。大家可以根據自己的實驗需求選擇相應的產品，也可以結合使用兩種方法對支原體進行鑒定以獲得可靠的檢測結果。

4.支原體清除

當發現細胞中存在支原體污染后，如果是不太重要或者有備份的細胞，可將培養物與用過的培養基滅活后丟棄即可。但對于珍貴的細胞就要選擇支原體清除試劑來處理細胞，并結合抗生素以*清除支原體來拯救比較重要的細胞樣品。

這里推薦Lonza的MycoZap廣譜支原體清除試劑，使用簡單，只需將支原體清除試劑加入培養基中，細胞毒性小，不影響細胞正常生理狀態，可在4天內去除大范圍支原體、無膽甾原體、植物花螺原體等柔膜菌綱物種；隨后的4-6周內，可以再用Lonza MycoAlert支原體檢測試劑盒進行不間斷檢測，以確保后續培養物不被污染。

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5.支原體預防

支原體非常頑強，盡管有可清除的試劑，對支原體污染的預防工作也是非常有必要的。主要可從以下幾個方面：

首先規范細胞培養技術始終是預防支原體感染的最佳方式，如細胞培養工作中多注意控制環境污染、嚴格實驗操作、細胞培養基和器材要保證無菌以及在細胞培養基中加入適量的抗生素等；

其次搭配使用預防試劑，如Lonza MycoZap支原體預防試劑特異性預防支原體污染的抗生素，其中MycoZap Plus可預防包括支原體、革蘭氏陽xing菌、革蘭氏陰性菌、真菌、酵母在內的多種微生物污染，其配方也根據細胞系、原代細胞進行了特殊優化。

最后定期檢測也很重要，支原體感染會使培養細胞慢慢枯萎，將定期支原體檢測常規化堅持下去，也是細胞培養實驗室應對支原體感染的關鍵。

建議檢測頻率

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談到支原體污染，小優還特別邀請到了Lonza資深應用技術專家做一場線上講座：

主題：支原體對細胞實驗的危害及快速檢測方法介紹

時間： 2021.6.7 周一16:00-17:00

地點：小優博士（小程序）

方式：直播+回放，可預約提醒

講座主要內容

• 什么是支原體污染，支原體污染對實驗影響的統計情況

• MycoAlert快速支原體檢測方法介紹

• 搭配Lucetta2.0的支原體檢測實驗流程

除了支原體污染相關的講座，近期小優攜手Lonza品牌開展了一系列的線上講座，敬請關注。

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