上一期我們為大家匯總了ELISA實驗原理、樣本準備和預實驗相關的十個常見問題及解答，可能有心急的小伙伴早就想要了解更多后續關于ELISA實驗方面的問題了，不要走開，接下來將給您帶來相關解答~
 

Q：in vivo實驗周期長，不太好做預實驗，對ELISA結果會有影響么？怎么辦？

A：如果您實驗室之前建立的in vivo實驗protocol經過驗證，可以保證有效性，那么，可以不用再進行相關的預實驗；并且，如果實驗周期較長，樣本獲取不易，同時又需要檢測較多指標，建議將樣品分裝凍存，避免反復凍融。ELISA實驗還是建議進行一下預實驗，摸清楚樣本的佳稀釋比例，取得更好的實驗結果。

Q：檢測樣本是細胞培養上清，那么細胞數目對炎癥因子的濃度有影響嗎？

A：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養細胞數水平接近一致。因不同處理，可能會導致細胞生產狀態不同，要保證在鋪板時接種細胞數量水平一致。

Q：打開試劑盒，發現wash buffer析出結晶，對實驗結果有影響么？怎么辦？

A：wash buffer為高濃度鹽溶液，在低溫保存條件下，有可能出現結晶析出，為正常現象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的結晶會溶解，溶解后可正常使用。不可以在結晶存在的情況下配置wash buffer。
 

Q：愛必信的ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

A：HRP酶標二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩定，曝光或污染氧化后會出現顯色反應，導致實驗背景升高，或無法使用，所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調整為雙組份，方便穩定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩定影響實驗結果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結果也沒有影響，可以放心使用。
 

Q：同一樣品多次ELISA檢測，測試結果差異大怎么解決？

A：應考慮的問題包括：

• 樣本保存不當，會導致多次實驗結果偏差較大，樣本應盡量減少反復凍融，如需多次檢測，需在取樣后分裝保存；
• 樣品凍融之后未混勻，應混勻后再上樣；
• 加樣不準確，微量樣品加樣時要注意移液器槍頭不要有殘留。

Q：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

A：復孔值差異較大，主要原因應考慮加樣是否準確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應注意移液器量程，以及槍頭殘留問題；洗板過程應注意不要有殘留液體，需要進行拍干操作；孵育過程要更換封板膜，拍干過程要換吸水紙，避免交叉污染。
 

Q：加完終止液之后測的幾次數據差別也蠻大，是什么原因？

A：加完終止液后，顯色反應也不是永遠停止，形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續加深，建議在15 min內讀數。
 

Q：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

A：ELISA實驗中，在酶標抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或將整個ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。
 

Q：封板膜什么時候用？每次加液后都要換嗎？

A：封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標抗體時，都要蓋好封板膜，減少揮發及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。
 

Q：ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機，需要如何操作？

A：實驗室ELISA實驗做的較多，還是建議使用洗板機洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒有洗板機，在洗板過程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復三次。
 

Q：手動洗板過程中，拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

A：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實驗結果的準確性。
 

今天的FAQ就到這里啦，小編在這里做個總結，實驗過程中重要的就是上樣、孵育和洗板，上樣要注意樣本混勻、加樣準確，孵育要蓋好封板膜，避免交叉污染，洗滌則要避免液體殘留，建議洗板機洗板，并且要拍干。注意這些細節問題，相信各位同學肯定可以得到好的ELISA實驗結果，下期我們再給您帶來ELISA數據獲取及處理方面的一些問題，感興趣的小伙伴們繼續關注吧~

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