1、血清封閉：

組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續結果的假陽性；因此需要使用封閉劑進行封閉。常用試劑為血清和BSA等。封閉血清一般是和二抗同一來源的，但不能與一抗來源一致。

 2、一抗和二抗濃度和孵育時間：

一抗孵育條件在免疫組化反應中zui重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時間與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，4度過夜（從冰箱拿出后37度復溫45min）。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。

3、抗體稀釋液：

抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可，另外還可以加NaN3防腐劑、BSA穩定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。
4、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：

為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要。需注意：

    （1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。

    （2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。

    （3）沖洗的時間要足夠，才能*洗去結合的物質。

    （4）PBS的PH和離子強度的使用和要求（建議 PH 7.4- 7.6，濃度是 0.01M；中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）。

5、DAB顯色：

背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗。

6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用蘇木素復染（胞核染料）。

7、封片：為了長期保存，一般用中性樹膠封片，避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

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